小鼠（Mouse）環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）ELISA 檢測試劑盒使用說明書 檢測原理 試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù) 先包被環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）抗體的包被微孔中，依次加入標本、標 準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色， TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終 的黃色。顏色的深淺和樣品中的環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）呈正相關(guān)。用 酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。 樣品收集、處理及保存方法 樣品收集、處理及保存方法 樣品收集、處理及保存方法 樣品收集、處理及保存方法 1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞 刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地 分離。 2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心 30 分鐘取上清。 3. 細胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘去除顆粒和聚合物。 4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心 10 分鐘 取上清。 5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于 -20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。 自備物品 1. 酶標儀（450nm） 2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3. 37℃恒溫箱 操作注意事項 1. 試劑盒保存在 2-8℃，使用前室溫平衡 20 分鐘。從冰箱取出的 濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶溶解 后再使用。 2. 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。 3. 濃度為 0 的 S0 號標準品即可視為陰性對照或者空白；按照說明 書操作時樣本已經(jīng)稀釋 5 倍，最終結(jié)果乘以 5 才是樣本實際濃度。 4. 嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。 5. 所有液體組分使用前充分搖勻。 試劑盒組成 名稱 96 孔配置 48 孔配置 備注 微孔酶標板 12 孔×8 條 12 孔×4 條 無 標準品 0.3mL*6 管 0.3mL*6 管 無 樣本稀釋液 6mL 3mL 無 檢測抗體-HRP 10mL 5mL 無 20×洗滌緩沖液 25mL 15mL 按說明書進行稀釋 底物 A 6mL 3mL 無 底物 B 6mL 3mL 無 終止液 6mL 3mL 無 封板膜 2 張 2 張 無 說明書 1 份 1 份 無 自封袋 1 個 1 個 無 注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0、3、6、12、24、48 nmol/L 試劑的準備 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按 1：20 稀釋，即 1 份的 20×洗滌緩 沖液加 19 份的蒸餾水。 洗板方法 1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置 1min 后甩盡 孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板 5 次。 2. 自動洗板機：每孔注入洗液 350μL，浸泡 1min，洗板 5 次。 操作步驟 1. 從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封 袋密封放回 4℃。 2. 設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品 50μL； 3. 樣本孔先加待測樣本 10μL，再加樣本稀釋液 40μL；空白孔不 加。 4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶 （HRP）標記的檢測抗體 100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴 鍋或恒溫箱溫育 60min。 5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置 1min，甩去 洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板 5 次（也可用洗板機洗板）。 6. 每孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。 7. 每孔加入終止液 50μL，15min 內(nèi)，在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值。 結(jié)果判斷 繪制標準曲線：在 Excel 工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應(yīng) OD 值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣 本濃度值。 試劑盒性能 1. 準確性：標準品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R 值，大于等于 0.9900。 2. 靈敏度：檢測濃度小于 1.0 nmol/L。 3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。 4. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于 15%。 5. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存。 6. 有效期：6 個月 免責聲明 1. 試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所 產(chǎn)生的一切后果，由實驗者承擔，本公司概不負責。 2. 嚴格按照說明書操作，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者 承擔。 本試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷 本試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷 本試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷 本試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷
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